Выделение чистой культуры дрожжевых грибов
Отдельные изоляты (штаммы) получают путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же среды, на которые производили первичный посев, но без добавления специфических ингибиторов.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).
Чистой микробной культурой называют популяцию, представляющую собой потомство одного вида микроорганизма. Каждый новый изолят носит название штамма, которому присваивают буквенное или номерное обозначение.
Расами называют производственные штаммы одного вида дрожжей, различающихся между собой по степени проявления физиологической активности.
В генетических исследованиях пользуются так называемыми клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки. (Бабьева И.П., Голубев В. И.).
Существуют прямые и непрямые методы получения чистых культур дрожжей. Первые основаны на выделении одной клетки или споры под непосредственным контролем через микроскоп. Во втором случае используют косвенные приемы для разделения клеток.
Капельный способ Линдера. Суспензию дрожжей разбавляют жидким суслом до концентрации ≈ 100 клеток в 1 мл и стерильным чертежным пером наносят мельчайшие капельки на необезжиренное покровное стекло, простерилизованное фламбированием в пламени газовой горелки. Капельки располагают в определенном порядке, обычно по пять капель в два ряда, т. е. всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над влажной камерой, которую запечатывают минеральной смазкой. Все капли немедленно просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по одной единственной клетке. Если все капли содержат по нескольку клеток, то увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют. После трех – четырехдневного инкубирования, когда отмеченные единичные клетки образуют микроколонии, последние переносят стерильной иглой или полоской стерильной фильтровальной бумаги в жидкую среду и размножают.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).
Метод Линдера в видоизменении Надсона. Чистое покровное стекло проводят трижды через пламя горелки и края его обводят мастикой (смесь равных частей парафина и вазелинового масла). На центральную часть стекла наносят полоску прозрачной среды ч 10% желатины или 0,5 агара. В теплую и еще не застывшую среду вносят иглой суспензию дрожжей такого разведения, чтобы в каплю попало всего несколько клеток. Стекло помещают во влажную камеру и рассматривают препарат при малом увеличении микроскопа. (Булгаков Н.И.).
Находят ориентиры, которыми могут быть частички взвеси, пузырьки воздуха или дефекты стекла, и вычерчивают карту с расположенными по отношению к ориентирам одиночными клетками дрожжей. Через каждые 10-20 ч препарат повторно исследуют, зарисовывая все изменения. Когда отмеченные клетки разрастаются в микроколонии, покровное стекло перевертывают на предметное и под контролем глаза при малом увеличении микроскопа переносят иглой материал в пробирки. ( Булгаков Н.И.).
Метод Линдера, упрощенный Вучковичем. Видоизменение Вучковичем метода Линдера сводится к тому, что капельки суспензии, содержащие 3-4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно захватывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверхность плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных клеток в отмеченной капельке.