Выделение чистой культуры дрожжевых грибов

Для фильтрации воздуха через жидкости используют прибор Киктенко, основанный на осаждении микробных клеток в улавливающей жидкости, которую затем переносят по 0,1 – 0,3 мл на плотную среду и проращивают.

Общий принцип посевов заключается в том, что образец превращают в такое состояние, когда он может быть серийно разведен, чтобы сделать из него высев или сразу в чашки, или перевести клетки сначала на мембранные фильтры. (Коновалов С.А. 1962)

В качестве суспензионных жидкостей используют стерильную водопроводную воду, в которую иногда добавляют поверхностно-активные вещества (например, Твин-80, 1капля на 0,5 л), 0,5%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде (при выделении психрофильных дрожжей).

Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке.

После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки.

При инкубировании посевов большое значение имеет поддержание определенной температуры. Преобладающее число видов дрожжей относится к группе мезофильных микроорганизмов с температурными границами роста от 2 – 5 до 30 – 37°С и оптимумом при 26 – 28°С. Среди дрожжей нет истинных термофилов, для роста которых требуются температуры выше 50°С. При выращивании дрожжей при температуре 40 – 45°С необходимо добавлять в среду олеиновую кислоту.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.)

Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования. Из теплокровных животных и из различных органов человека и связанных с ним субстратов дрожжи выделяют при 37°С, если хотят найти патогенные формы, и при 28°С в случае поиска сапрофитных видов. Если дрожжи растут при 37°С, то требуется соблюдать осторожность, так как среди них могут быть патогенные – Cryptococcus neoformans или Candida albicans (=Syringospora albicans).

Посевы из материала, где предполагается наличие психрофильных дрожжей, инкубируют в холодильнике при температуре 4 – 5°С.( Коновалов С.А. 1967).

Сроки инкубирования непосредственно зависят от температуры. При 37°С инкубируют не более 4, а в холодильнике не менее 14 сут. Если дрожжи дают визуально заметный рост при 4 – 5°С в течение 7 – 10 дней, то их относят к истинным психрофилам при условии, что выше 20°С они не растут. Температурный оптимум таких дрожжей находится обычно в диапазоне от 10 до 15°С. Психротолерантные дрожжи вырастают при 5°С в течение 2 – 3 недель, а психрофобные при температуре ниже 30°С не растут совсем. В посевах из почвы, инкубируемых при низких температурах, удается учесть в 2 – 3 раза больше дрожжей, чем при 28°С, так как росту дрожжевых колоний при этом не мешают грибы с быстро распространяющимся мицелием. Учет опытов в этих случаях следует производить дважды – через две недели и через месяц.

Стандартные полноценные питательные среды. Эти среды применяют с целью наиболее полного учета и выделения большинства видов дрожжей. Наиболее широко используемой полноценной средой для выращивания дрожжей является солодовое сусло. В его состав входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза и мальтотетраоза, а также небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза и рибоза. Азотные компоненты составляют 6 – 7% сухих веществ (СВ), среди них аммонийного азота 2,18 – 2,44 мг на 100 мл. В сусле имеются аминокислоты, все основные витамины группы В и минеральные вещества, содержание которых зависит от используемой воды.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).