Выделение чистой культуры дрожжевых грибов
Росту дрожжей на питательных средах при высеве из исходного материала зачастую препятствуют грибы с широко распространяющимися по поверхности субстрата мицелиальными колониями. Они имеют общие с дрожжами потребности в источниках питания, устойчивы к низким значениям рН среды и нечувствительны к действию указанных выше противобактериальных антибиотиков. Для ограничения роста микромицетов в среду добавляют специфические вещества: дифенил (0,005-0,01%), бычью желчь (0,25-0,5%), теллурат калия (0,05-0,15%), пропионат натрия (0,15-0,25%), – или некоторые красители: бром-крезоловый пурпурный (0,0025% или 2,5 мл/л 1% раствора), бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый (0,001%).( Грин Д.).
Элективные среды. Их применяют для дрожжей из специфических мест обитания.
Осмофильные дрожжи, обитающие в природе в гнездах диких пчел (в меде), обнаруживаемые в производстве сахара и при порче меда или других продуктов с большим содержанием сахара, выделяют на средах с высоким осмотическим давлением: на медовом и осмофильном агарах.
Состав сред: медовый агар: 70% меда в водопроводной воде и 2% агара; синтетический «медовый» агар: 60 г глюкозы, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г агара, 100мл воды; осмофильный агар: б сироп, содержащий 35 массовых частей сахарозы и 10 частей глюкозы, добавляют агар и стерилизуют 20 мин при 112°. Повторное расплавление не рекомендуется.
При выделении осмофильных дрожжей посевы делают на указанные среды и для сравнения – на обычные. Сахар, мед или сиропы растворяют в воде и фильтруют через мембранные фильтры, которые затем помещают для проращивания на агаровые среды. (Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С). Почвенные олигонитрофильные дрожжи Lipomyces выделяют на безазотистых средах. Примером такой среды может служить модифицированный агар Эшби (в г 1л дистиллированной воды) : Сахароза − 20,0; K2HPO4 − 0,2; KH2PO4 − 0,1 ; MgSO4·7H2O − 0,2 ; NaCl − 0,2; K2SO4 − 0,1 ; Агар − 20,0.
Для подавления роста бактерий к этой среде добавляют 80 мг/л стрептомицина. Посев производят комочками почвы: навеску в 100 мг распределяют на две чашки Петри, по 50 комочков на каждую. Для равномерного распределения используют трафарет, который подкладывают под чашку. Учет обрастаний производят через 25-30 сут. инкубирования при комнатной температуре. Результат выражают в процентах обрастания комочков почвы молочно-белыми слизистыми колониями липомицетов. (Коновалов С.А.).
Дрожжевые колонии в посевах учитывают следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяют чернилами на большее или меньшее число частей – от четырех до шестнадцати в зависимости от густоты посева – и просматривают все колонии на каждой площади с объективом 10× в просвечивающем микроскопе или с бинокулярной лупой в отраженном свете. Описывают все встречающиеся типы колоний в стандартных терминах. Из них готовят препараты и микроскопируют при больших увеличениях. Этот детальный просмотр колоний при первом посеве очень важен, так как при последующих пересевах некоторые признаки, например спорообразование, иногда исчезают. Рекомендуется сразу же делать фотографии или зарисовки. Колонии разных типов нумеруют и просчитывают отдельно.( Фениксова Р.В.).
Учет производят дважды. В первый срок отмечают с обратной стороны чашки все выросшие и просчитанные колонии, а за тем оставляют чашки еще на несколько дней для наблюдения за возможным появлением колоний медленно растущих дрожжей.