Выделение ферментов

Наряду с этим очень продуктивным штаммом в промышленности всё больше используются другие бактериальные продуценты нейтральных и щелочных протеаз, которые являются мутантными вариантами или культурами, отобранными в процессе длительной естественной селекции. Среди промышленных бактериальных штаммов можно назвать: В. cereus, В. mesentericus, В. licheniformis (продуцент препарата субтилизин Карлсберга), В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis (продуценты промышленных препаратов субтилизин BPN и субтилизин Novo) и некоторые другие.

Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место, чем бактерии, занимают актиномицеты и микроскопические грибы. Актиномицеты образуют внеклеточные протеиназы в значительных количествах, но они сравнительно редко используются в промышленных условиях. Очень многие актиномицеты одновременно с протеиназами образуют большое количество внутриклеточных антибиотиков, поэтому имеется возможность одновременно организовать два производства: антибиотиков – из биомассы продуцента и протеолитических ферментов – из жидкой фазы культуры. По такому принципу начиная с 60-х годов в Японии получают протеиназы на основе производства стрептомицина при промышленном культивировании Streptomyces griseus. Протеазы S. griseus получают из фильтрата глубинной культуры путем избирательной сорбции катионообменными смолами. Протеаза после элюции и дальнейшей очистки очищается в 22 – 25 раз и известна на мировом рынке под названием проназы. Проназа является комплексным препаратом, состоящим, по данным различных авторов, из 11 – 13 протеаз: четырех нейтральных, грех щелочных протеиназ и 3 – 5 аминопептидаз и карбоксипептидаз. Это стабильный ферментный препарат, обладающий широкой специфичностью и способностью глубоко (на 70 – 90 %) гидролизовать субстрат до аминокислот. Только кератин и фиброин шелка с трудом гидролизуются проназой. Проназа также гидролизует различные пептиды, амиды и эфиры аминокислот. Она растворима в воде, слабых солевых растворах, водных растворах ацетона и спиртов с концентрацией не выше 50%. Оптимальный рН лежит в щелочной зоне – от 8 до 9; при рН ниже 4 и выше 10 протеазы инактивируются. Стабилизируется проназа ионами кальция, нейтральные протеиназы и пептидазы проназы являются металлоферментами. Пептидазы ингибируются ЭДТА, причем в присутствии ионов кальция и кобальта этот эффект снимается.

Препараты проназы широко используются в различных отраслях промышленности, особенно при щелочных значениях рН. Препараты прекрасно хранятся при комнатной температуре и полностью сохраняют свою активность в течение 3 и более лет. Препараты проназы содержат ферменты, очень близкие по механизму своего воздействия на субстрат к трипсину и химотрипсину. Поэтому в литературе можно встретить для трипсиноподобных протеиназ проназы с различными названиями: протеиназа В, БАЭЭ-гидролаза; трипсин S. griseus, трипсин проназы и т. д. Протеиназы проназы со свойствами, близкими к химотрипсину, в литературе называются: протеиназа С, протеаза А, n-нитрофенилацетатгидролаза 1 и 2, фракция В, эластазоподобный фермент, эндопептидаза В, химотрипсин проназы и др. Следует отметить, что химотрипсинподобный фермент S. griseus обладает высокой эластазной активностью. Вероятно, это комплексный фермент, имеющий в своем составе фрагмент эластазного фермента. Наличие в препаратах проназы пептидаз, вероятно, способствует более полному расщеплению белков и пептидов до аминокислот.

Микроскопические грибы очень длительное время использовались для синтеза нейтральных и особенно кислых протеиназ. Наиболее часто для этих целей применялись различные виды аспергилловых грибов: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. terricola, A. sojae, P. chrysogenum, Monilia sitophila. Эти микроорганизмы образуют протеазы, зона действия которых лежит в интервале рН от 4 до 10 с проявлением максимальной активности при рН, близком к нейтральному. Большой интерес представляют продуценты видов: A. awamori, A. saitoi, Rhizopus javanicus, Rh. pygmaues, Penicillium expansum, P. sponolasum и др., которые образуют кислые протеиназы с оптимальным рН 2,0 – 2,5. Все кислые протеиназы по механизму воздействия на субстрат достаточно близки, но пока нет стройной гипотезы, объясняющей существо протекающей реакции и её механизм.