Определение протеолитической активности (метод Вильштеттера и Вальдшмидт – Лейтца в модификации)

Данный метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Протеолитическую активность выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-го раствора желатина с рН 7,3–7,5 1 см3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40°С. За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 см3 аминного азота за 1 ч в принятых условиях опыта.

Для проведения анализа необходимы реактивы: фосфатный буферный раствор с рН 7,3–7,5; 5%-ный раствор желатина (субстрат) – 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15–20 см3 дистиллированной воды в течение 20–30 мин. Набухший белок заливают 20–25 см3 буферного раствора температурой 70–80°С и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см3 к не растворившейся части добавляют еще 20–25 см3 буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Так повторяют до полного растворения желатина. Охлажденный до 40°С раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры.

Перед анализом раствор желатина нагревают до 40°С на водяной бане; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина – 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96% спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см3 и после растворения доводят до метки; 0,1 н раствор щелочи; 96%-ный этиловый спирт.

К 10 см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3–7,5 приливают 2 см3 испытуемого ферментного раствора и сразу не отбирают 1 см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50–100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спирта и 0,2 см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором щелочи. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см3.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40°С для гидролиза. Через 3 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбу на 50–100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спирта и 0,2 см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности (ПС) ведут по формуле (2):

А

ПС = –, (2)

(t ´P)

где ПС – протеолитическая активность, ед/г;

А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см3 жидкого ферментного препарата.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А = (а – ак) ´1,4 ´К, (3)

где а – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см3 раствора опытного, см3;

ак – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см3 контрольной пробы, см3;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.