Выделение микробных липаз из микроорганизмов

Известны микроорганизмы, продуцирующие липазы, оптимум действия которых находится в области высоких температур: 50–550С Pseudomonas fragi, 700С Pseudomonas mephitica. В связи с этим представляется актуальным поиск активных продуцентов липаз, специфичных к твердым жирам, содержащимся в промышленных отходов, а также продуцентов липаз с более высокими температурными оптимума действия. Такие исследования имеют большое значение в связи с экологическими проблемами, связанными с очисткой сточных вод в масло-жировой промышленности /45/.

Первоначально скрининг продуцентов липаз проведен качественным методом Эйкмана, при котором в стерильные чашки Петри разливают тонким слоем простерилизованный животный жир и после его застывания вводят агаризованную питательную среду. Культуры высевали на питательную среду для получения гигантских колоний. Чашки выдерживали в термостате при 28–300С для мезофильных и 38–400С для термофильных культур в течение 5–7 суток, учитывали и отбирали культуры, вокруг колоний которых образовывались непрозрачные зоны гидролиза жиров. Активными считали культуры, образующие зоны, превышающие диаметр колоний. Для количественного определения липазной активности грибы выращивали в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке (150 об/мин) в течение 3–4 суток при 36–400С. Посевным материалом для иннокуляции питательной среды служила суспензия спор гриба. Липазную активность определяли в фильтрате культуральной жидкости. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождает 1 мкМ олеиновой кислоты из 40% эмульсии оливкового масла в 10% растворе поливинилового спирта за 1 ч в условиях опыта.

При глубинных условиях выращивания липазную активность культур выявляли на различных питательных средах (%):

1) видоизмененная среда Чапека:

а) KH2PO4 – 0,1; MgSO4*7H20 – 0,05; FeSO4 *7H20–0,01; CaCO3-0,3; хлопковое масло и пептон – по 0,1;

б) минеральный состав с добавлением хлопкового масла и кукурузного экстракта по 1,0;

2) среда из 7% экстракта солодовых ростков с добавлением (NH4)2SO4 – 0,3; CaCO3 – 0,1 и хлопкового масла – 1,0;

3) среда с гидролизатом БВК -1,0; (NH4)2SO4 – 0,3; CaCO3 и хлопковое масло – по 0,1; рН питательных сред – 6,5–7,0.

Внутриклеточную липазную активность определяли в гомогенате сырой биомассы. Для этого 0,5 г биомассы, тщательно отмытой дистиллированной воды, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, доводили объем до 50 мл дистиллированной воды и выдерживали 2 ч при комнатной температуре, затем отфильтровывали через бумажный фильтр и фильтрат использовали для анализа. Активность рассчитывали на 1 г абсолютно сухой биомассы /46/.

Другой способ биосинтеза липазы заключается в следующем. Сначала была получена культура дрожжей Candida paralipolytica 739. Работа началась с использования питательной среды следующего состава (%): (NH4)2SO4 – 0,3; MgSO4 – 0,07; NaCl – 0,05; Ca(NO3)2 – 0,04; KH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,1; глюкоза – 0,5; дрожжевой автолизат – 0,1 (по сухому веществу). В качестве посевного материала использовали 48-часовую культуру, выращенную на косом агаре. Для опытов культуру дрожжей выращивали при 300С в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды на качалке при 240–250 об/мин в течение 2-х суток. Липазную активность в культуральной жидкости определяли по количеству олеиновой кислоты, образовавшейся в результате действия фермента на оливковое масло. В международной практике эмульсию оливкового масла в поливиниловом спирте в качестве субстрата используют для определения липазной активности и, в частности, для экзолипазы дрожжевой культуры Candida paralipolytica /47/. В данном опыте реакционная смесь содержала 2,5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте, 2 мл 1/15 М фосфатного буфера с рН 8 и 0,5 мл ферментного раствора. Реакцию проводили при 370С в течение 1 ч и прерывали добавлением 15 мл этанола. Полученную смесь титровали 0,05 н. NaOH в присутствии индикатора тимолового синего. Контрольные образцы обрабатывали так же, но без предварительной инкубации и немедленно оттитровывали. Результаты титрования определяли по разности между контролем и опытом. За единицу активности принимали количество, способное высвобождаться 1 мк/моль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 8,0 и температуре 370 в течение 1 ч /48/.

При биосинтезе ферментов микроорганизмами большое значение имеют условия развития культуры и в первую очередь состав питательной среды. В связи с этим представляло интерес изучить влияние солей среды не биосинтез липазы культурой Candida paralipolytica 739. Путем поочередного исключения солей установили, что все минеральные соли, входящие в состав питательной среды необходимы для биосинтеза фермента. Выявили, что на образование липазы положительно влияют соли аммония и мочевина, нитраты заметно снижают активность липазы. Также проверяли зависимость липазной активности в культуральной жидкости от возраста посевного материала. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: