Мутагенез и методы выделения мутантов

Кроме того, реверсии могут произойти благодаря супрессорным мутациям. При внутригенной супрессии вторая мутация возникает в том же гене, что и первичная мутация, и приводит к более или менее полному восстановлению функции белка. При внегенной супрессии вторая мутация затрагивает другой ген. Так, ошибки кодирования, связанные с нонсенс-мутациями и некоторыми мутациями со сдвигом рамки, могут частично исправляться мутациями в генах, кодирующих РНК Восстановленная активность поврежденного белка при этом обычно не превышает 10 % от исходного уровня.

Когда невозможно провести прямой отбор мутантов, исследуют колонии на индикаторных чашках, применяют тесткультуры микроорганизмов или перепечатывают колонии на различные среды, т. е. используют метод отпечатков, или реплик. Иногда приходится выращивать каждую колонию и определять в культуральной жидкости интересующую активность. Индикаторные чашки дают возможность различать мутанты по цвету колоний и проводить тестирование разнообразных фенотипов в больших популяциях. Такие чашки могут содержать среды с индикатором, выявляющим различие в рН между теми колониями, которые метаболизируют определенные углеводы, и теми, которые не обладают такой способностью. Так, на агаре с трифенилтетразолием колонии, не сбраживающие лактозу, приобретают ярко-красный цвет, а колонии, сбраживающие этот дисахарид, остаются неокрашенными. Используются также специально приготовленные субстраты, распадающиеся с образованием красителя при их гидролизе ферментами, наличие которых тестируется на этих чашках. Иногда вносят субстраты, изменяющие прозрачность сред, и наблюдают образование вокруг колоний мутантов зон просветления.

В 1952 г. Д. Ледерберг и Э. Ледерберг ввели для непрямого отбора мутантов метод отпечатков (рис. 6). Согласно этому методу, чашки Петри засеваются с таким расчетом, чтобы на каждой из них выросло 50—200 колоний. Стерильный бархат или фильтровальную бумагу натягивают на металлический или деревянный цилиндр и закрепляют металлическим кольцом. Чашки с выросшими колониями переворачивают и прикладывают к бархату. Затем к этому же бархату (с отпечатками колоний на нем) прикладывают чистые чашки с различными средами. После соответствующей инкубации на них образуются колонии в том же расположении, что и на исходной (матричной) чашке. Если матричная чашка содержала полноценную среду, то отпечатками на минимальные среды можно выявить ауксотрофные мутанты. Различные модификации этого метода широко используются для выделения мутантов с питательными потребностями, а также мутантов, чувствительных к различным физическим, химическим и биологическим агентам (температура, антибиотики, фаги и др.).

Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков может быть облегчено, если обогащать ими популяцию клеток, используя пенициллин или его аналоги. Эти антибиотики убивают только растущие клетки. Например, ауксотрофные по треонину мутанты Е. coli не растут на минимальной среде без треонина. В этих условиях пенициллин будет убивать только прототрофные клетки. Однако полной селекции ауксотрофов эта процедура не обеспечивает.

Иногда приходится проводить несколько циклов обработки пенициллином, попеременно выращивая бактерии в среде с треонином без пенициллина и в минимальной среде без треонина с пенициллином. После одного цикла достигается обогащение желаемыми мутантами в 1000 и даже в 10000 раз. Следовательно, если необходимая мутация возникает спонтанно с частотой 10~7, то достаточно просмотреть несколько тысяч колоний, выживших после обработки пенициллином, чтобы найти колонию с нужной мутацией.