Возможности генной инженерии

В последние годы для получения новых эффективных штаммов- продуцентов аминокислот стали применять новейшие методы биотехнологии. Методы генетической инженерии позволяют повышать количество генов биосинтеза путем их клонирования на плазмидах. Это приводит к увеличению количества ферментов, ответственных за синтез аминокислот, следовательно, повышает выход целевого продукта. Клонирование генов системы синтеза аминокислот в клетки микроорганизмов с иным, по сравнению с донорским организмом, типом питания позволяет расширять сырьевую базу и заменять дорогостоящие сахаросодержащие субстраты более дешевыми.

Технология рекомбинантных ДНК представляет собой изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть.

Эта технология основана на следующем принципе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК, называемые плазмидами.

Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ.

Плазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.

Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы. Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется (рис. 5).

Рис. 5: Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы.

Штаммы – суперпродуценты, используемые в производстве, как правило, получены с использованием методов селекции и генетики. Получены микробы – суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium, Microccocus и другие,с помощью которых освоено крупнотоннажное производство глутамата и других аминокислот.

Известны продуценты L-глютаминовой кислоты Corynebacterium glutamicum с высокой супероксидисмутазной активностью (патент Японии 5-29436 C 12 P 13/14), продуцирующие до 100 г/л глютаминовой кислоты, получен мутант Corynebacterium glutamicum, содержащий рекомбинантную ДНК с фрагментом, несущим ген, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу из Escherichia coli (патент Японии 4-17639 C 12 P 13/14). Основным недостатком всех вышеперечисленных штаммов и мутантов является непродуктивный расход углеродсодержащих субстратов на биосинтез молочной кислоты, при этом при культивировании всех приведенных штаммов выход глютаминовой кислоты от субстратов составлял не более 56%.

Новый штамм бактерий Corynebacterium glutamicum был получен мутацией штамма АТСС 4128. Клетки исходного штамма подвергали УФ-мутагенному воздействию. Отбор проводили с помощью биоавтографического метода. Бактериальные клетки, выросшие на чашках, убивали УФ-облучением, после этого чашки заливали агаризованной средой, содержащей суспензию клеток штамма, нуждающегося в L-глутаминовой кислоте. Рост такой индикаторной бактерии подтверждал выделение исследуемым штаммом L-глютаминовой кислоты. Прямой отбор среди 100 вариантов, полученных после обработки клеток исходного штамма АТСС 4128, позволил выявить 8 штаммов, обладающих способностью к синтезу L-глютаминовой кислоты, далее мутанты отбирались по двум признакам: резистентности к Na-триевой соли ампициллина и выходу от поданного углеродсодержащего субстрата более 60%. При выращивании на жидкой синтетической питательной среде с добавлением источников N, P, K, Na, Mg, биотина, тиамина, содержащей сахарозу в количестве 40 г/л, был отобран штамм ВСБ-206л, способный к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты с выходом от потребленной сахарозы 63%. Штамм Corynebacterium glutamicum (ВСБ-206л) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики под номером B-7198. Физиолого-биохимические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, ацетат, этиловый спирт. Нуждается в добавках биотина, тиамина, способны к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты, обладает пониженной активностью лактатдегидрогеназы, что снижает затраты углерода субстрата на жизнедеятельность бактерий, уменьшает непродуктивный расход углерода на биосинтез молочной кислоты.